Xevo MRT新型多反射高分辨质谱仪（
https://www.waters.com/nextgen/cn/zh/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-mrt.html）以其杰出的整体性能提供更高的质量分辨率（100,000 FWHM）、更准确的质量数（<500 ppb）、更快的采集速率（100 Hz），非常适合代谢组学研究领域。 本实验使用Xevo MRT进行人粪便样本代谢组学分析，使用数据依赖型采集模式（DDA）进行数据采集，其结果显示，该仪器能够提供出色的质谱分辨率，长期的系统稳定性；同时其高灵敏度、采集速度和质量精度，保证了MS/MS覆盖率和化合物鉴定数量。
1 样品前处理
取粪便样品50 mg，加入500 μL预冷的80%乙腈，振荡15 min；12,000 rpm，4 C下离心10 min；取上清液进行浓缩，使用100 μL纯甲醇复溶后，放入进样瓶中用于LC-MS分析。
质控混样：取待研究的每个生物样品的少量等分试样，将它们充分混合，然后定期进样。
2 实验条件
液相色谱条件
液相系统：ACQUITYTM Premier UPLC System（https://www.waters.com/nextgen/cn/zh/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-premier-system.html）
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1x 100 mm, 1.8 μm)（https://mp.weixinbridge.com/mp/wapredirect?url=https%3A%2F%2Fwww.waters.com%2Fnextgen%2Fcn%2Fzh%2Fshop%2Fcolumns%2F186003539-acquity-uplc-hss-t3-column-100a-18--m-21-mm-x-100-mm-1-pk.html%3Fxcid%3Dsm-post_28739&action=appmsg_redirect&uin=&biz=MzAwMDEyODU3OQ==&mid=2649952542&idx=2&type=1&scene=0）
流动相A：0.1% 甲酸水
流动相B：0.1% 甲酸乙腈
柱温：40 ℃
样品室温度：10 ℃
进样量：1 μL
梯度：详见下图
质谱条件
质谱系统：Xevo MRT MS
采集模式：DDA, Top 15
离子化模式：ESI+
离子源温度：120 ℃
脱溶剂气温度：550 ℃
毛细管电压：1.0 kV
锥口电压：20 V
锥口气流速：100 L/hour
脱溶剂气流速：1,000 L/hour
3 数据处理软件
使用waters_connectTM软件（https://www.waters.com/nextgen/cn/zh/products/informatics-and-software/waters_connect/waters-connect-informatics-platform.html）进行数据采集，在waters_connect的MS Toolkit应用程序中将数据进行可视化，并通过MARS组学软件（Mass-AnalyticaTM）进行数据处理，使用人类代谢组数据库（HMDB）进行化合物鉴定。
4 实验结果
①样品基峰色谱图（BPI）图展示,见图3：为单针人粪便样本对应的BPI图，色谱分离度良好。
②Xevo MRT MS的高灵敏度和采集速度，可以提供足够多高质量的MS/MS谱图，用于后续的鉴定；如下图所示，样品在约0.01 min的时间窗口内（5.621-5.630 min, 6.639-6.650 min）可以采集到10张MS/MS谱图，单针30 min的检测时长，可以采集到20,000+的MS/MS谱图。
③质控混样叠加图展示，见图5：样品，空白及质控混样共200针，每针30 min检测时长，连续跑样100小时，其中每隔15针插入一针混样用于质控，如下所示，所有混样谱图叠加良好，表明仪器具有很强的稳定性和抗污染能力，适用于大队列组学研究。
④使用MARS组学软件进行数据处理，共提取到72,970个特征离子，其中39,841个特征离子得到MS/MS，MS/MS覆盖率达到50%以上。对上述数据进行过滤（MS/MS过滤，QC过滤，空白过滤，RT过滤等），最终可得到6,077个特征离子，然后使用HMDB数据库进行鉴定（包含217,753个化合物，50,412张MS/MS谱图），最终有3,380个化合物可得到鉴定结果。其中以离子m/z 176.0707@5.65 min为例，鉴定结果为吲哚乙酸，它常被视为肠道菌群代谢活性的特征代谢物之一，其质量偏差为500 ppb。
5 实验结论
本实验采用ACQUITY Premier UPLC-Xevo MRT进行DDA模式采集，结合代谢组学软件对人粪便样本进行代谢组学分析：
01 Xevo MRT MS采用多反射超高分辨率飞行时间（MRT）技术可在较宽的m/z范围内提供始终如一的质谱分辨率。
02 创新的采集系统配备双增益模数转换器，使其在高动态范围内亦可保持长期的系统稳定性：样品、空白及混样共200针，每针30min检测时长，连续跑样100小时，其中每隔15针插入一针混样用于质控，质控混样谱图叠加良好。
03 Xevo MRT MS的高灵敏度、采集速度和质量精度，保证了MS/MS覆盖率和化合物鉴定数量：单针30 min的检测时长，可以采集到20,000+MS/MS谱图；所有样品共提取到72,970个特征离子，其中39,841个特征离子得到MS/MS，MS/MS覆盖率达到50%以上；对数据进行过滤，可得到6,077个化合物，使用HMDB数据库进行搜库，最终有3,380个化合物可得到鉴定结果。
参考文献
[1] MARS: A Multipurpose Software for Untargeted LC–MS-Based Metabolomics and Exposomics.”Analytical Chemistry 96.4(2024):1468-1477
[2] Goracci, Laura , et al. “Lipostar, a Comprehensive Platform-Neutral Cheminformatics Tool for Lipidomics.” Analytical Chemistry (2017):acs.analchem.7b01259.
[3] Gall, Le , et al. “Metabolomics of fecal extracts detects altered metabolic activity of gut microbiota in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome.”.